برابر بندپایان فقط در برابر رطوبت نسبتا بالا موثرند و از طرفی میزان اثر قارچ های پاتوژن متکی به گستردگی وسیع و تراکم جمعیت بندپایان است. قارچ های انتوموپاتوژن مشابه بسیاری از قارچ های پاتوژن گیاهان و مهره داران میزبانهای خود را از طریق کوتیکول خارجی عفونی و متاثر می کنند که این روش عفونت زائی منحصر به فرد است. قارچ ها مشابه دیگر میکروارگانیسم های انتوموپاتوژن شامل باکتری ها، ویروسها و میکروسپوریدیاها، کوتیکول میزبان خود را به طرف لوله گوارشی سوراخ می کنند[1].

روند عفونت زایی قارچ ها بر روی حشرات سه مرحله تشخیص داده شده است:
الف: اتصال و رشد کنیدیوم قارچ بر روی کوتیکول میزبان.
ب: نفوذ و سوراخ کردن تگومنت حشرات توسط لوله تندش (Germ tube) که این لوله به دنبال رشد کنیدیوم تولید میشود.
ج: روییدن قارچ در داخل بدن حشره که معمولا منجر به مرگ میزبان عفونی شده میگردد] 1,5.[

شکل 2-1 : روند استقرار یک عفونت قارچی را در یک بی مهره نشان میدهد] 1.[
A – چسبیدن کنیدیومها بر روی کوتیکول
B – رشد و نمو (جوانه زدن) کنیدیوم ها
C – سوراخ کردن و نفوذ به کوتیکول توسط لوله تندش
D – کلونیزه شدن در هموسل و برانگیختن واکنش های دفاعی میزبان

الف- تماس بین اسپور های قارچی و بندپایان:
این امر یک ضرورت و پیش نیاز برای ایجاد عفونت قارچی است. در اغلب موارد قارچ های انتوموپاتوژن اسپور هایی تولید میکنند که از طریق هوا منتقل میگردد (Air born spore). چنین تماسی به شکل اتفاقی صورت میگیرد و شانس موفقیت به مقدار زیادی بستگی به شرایط آب و هوایی و تعداد قارچ تلقیح شده و تراکم میزبان دارد.
در واقع در جست و جو به دنبال میزبان توسط اسپور های متحرک، فرایند های کیموتاکتیک نقش دارند. قارچها از نظر شیمیایی به وسیله متابولیتهای آزاد شده توسط میزبان جذب میشوند] 63.[
اپیکوتیکول و یا خارجیترین لایه تگومنت مکان مناسب برای شروع واکنش بین قارچ و میزبان است ]20,21.[

ب- رشد و نمو اسپور روی بدن میزبان (Germination):
از زمانی که اسپور به کوتیکول میزبان میچسبد باید رشد و نمو کند و ایجاد لوله تندش نماید. قارچ با این لوله به داخل کوتیکول نفوذ مینماید. میسلیوم ها نیز نقش سوراخ کردن و نفوذ را بازی میکنند ضمن این که ساختار های رشد و نمو در اتصال محکم و موثر اسپور قارچ به کوتیکول حشرات نقش موثری دارند. اسپورهای نمو یافته از گونههای متعدد قارچ های انتوموپاتوژن از قبیل متاریزیوم آنیزوپلیه و بواریا باسیانا تولید یک سلول اپرسوریال (Appressorial cell) در حد فاصل یا فضای بین لوله تندش و اپیکوتیکول مینمایند. گزارش شده که اپرسوریوم (Appressorium) با یک ترکیب موکوس مانند بیشکل پوشیده شده که مسئول اتصال این ساختار به سطوح کوتیکول میباشد. هر چند مرحله رشد و نمو به عنوان یک مرحله حیاتی در به وجود آمدن یک عفونت قارچی در بندپایان و تعیین پاتوژنیستی جدایه های قارچی تشخیص داده شده است، اما فاکتور های کلیدی کنترل رشد و نمو اسپورهای قارچ های انتوموپاتوژن به طور کامل شناسایی نشده است.

ج- سوراخ کردن تگومنت میزبان ( نفوذ در تگومنت میزبان) :
رشد و نمو موفق روی کوتیکول میزبان همیشه مترادف با عفونت در حشره نیست. میلنر(Milner) در سال 1982 گزارش کرد، کنیدیوم های ارینیا نئوفیدیس (Erynia neoaphidis) قادرند روی بیوتیپ های حساس و مقاوم شته ها تکثیر شوند اما نفوذ و سوراخ کردن کوتیکول در شته های مقاوم مهار میگردد.
رسیدن اجزاء قارچی به داخل بدن حشره که ضرورت برای ایجاد عفونت است متکی به توانایی لوله تندش در نفوذ به اپیکوتیکول خارجی و پروکوتیکول داخلی است.
کوتیکول به دلیل استحکام خود در حقیقت مانع اصلی در ایجاد عفونت قارچی است و مدتهای مدیدی است که مشخص گردیده است که حشرات زخمی و آسیب دیده، به پاتوژن های قارچی ضعیف و حتی ساپروفیتها از قبیل موکور و فوزاریوم مستعد میشوند] 65.[
نفوذ به تگومنت سخت و با صلابت به واسطه فعالیتهای مکانیکی و آنزیماتیک لوله توسعه یافته اتفاق می‏افتد. برگشت غشاهای کوتیکول متعاقب نفوذ قارچ ها به طور مشخص نشان دهنده فشارهای مکانیکی و دخالت عوامل مکانیکی در نفوذ قارچ ها به داخل تگومنت است و به هر حال تغییرات کوتیکول در طول سوراخ کردن و نفوذ قارچ ها مشاهده شده است] 39.[
مطالعه روی متاریزیوم آنیزوپلیه توسط استی لیگار (St .Legar) و همکاران در سال 1986 نشان داد که تمام جدایه ‏های حاد این گونه بیشترین میزان پروتئاز ها را تولید میکنند. از بین پروتئاز ها کیموالاستاز و یک آنزیم شبیه تریپسین بیشترین فعالیت را نشان میدهند. نقش این پروتئاز ها در نفوذ و سوراخ کردن کوتیکول با استفاده از مهارکننده های پروتئاز در سطح کوتیکول که باعث تاخیر مشخص و قابل قبولی در مرگ و میر حشرات در مقایسه با گروه کنترل گردید مورد تائید قرار گرفته است] 61.[

مطلب مشابه :  پایان نامه ارشد با موضوع محاربه در حقوق فقهای شافعی و حنفی

د- رشد و نمو قارچ داخل بدن میزبان:
اگرچه بندپایان دارای یک سیستم ایمنی ساده و اولیه به خصوص فاقد ایمونوگلوبولین هستند ولی قادرند که بین خودی و غیرخودی تمایز قائل شوند و نسبت به ورود پاتوژن های قارچی به داخل بدن به طور فعال واکنش نشان دهند] 12.[
مکانیسم های دفاعی در بندپایان از انواع سلولی و یا همورال گزارش شده است. فاگوستیوز به ندرت شرح داده شده است و احتمالا به دلیل اندازه بزرگ اسپور های قارچی (در مقایسه با باکتریها) بلع اسپور ها توسط هموسیت ها خیلی مشکل است. به هر حال به نظر میرسد که توکسین هایی از قبیل دستروکسین ها (Destruxins) مشابه فاگوسیتوزیس عمل کنند. پاسخ سلولی اصلی و مهم حشرات واکنش دفاع چند سلولی هموسیت ها علیه مواد قارچی است که به دنبال تشخیص قارچ توسط هموسیت ها شروع میشود] 64.[
بنابراین از میان 3 فاز تشخیص داده شده در به وجود آمدن و استقرار یک عفونت قارچی در یک بندپا دو فاز اولیه شامل اتصال و تکثیر اسپور های قارچی روی تگومنت و سوراخ کردن کوتیکول توسط لوله تندش بسیار حیاتی و ضروری است.
واکنش دفاع چند سلولی هموسیت ها و یا واکنش همورال در صورت حضور، به نظر میرسد که فقط در برابر پاتوژن های ضعیف یا دوزهای خیلی پایین پاتوژن های مهاجم موثر باشد. برای مثال این امر در ساپروفیت های با رشد سریع که میتوانند به راحتی یک حشره را پس از نفوذ مستقیم به داخل هموسل یا پس از ایجاد یک زخم در کوتیکول عفونی کنند، نشان داده شده است] 65.[
مطابق مطالعات گیندن و همکاران مکانیسم اثر قارچ های انتوموپاتوژن در برابر کنه های ماده خونخورده ریپی سفالوس آنولاتوس متفاوت است به طوری که حادترین سویه های متارزیوم آنیزپلیه 3-2 روز بعد از تلقیح، شروع به کشتن ماده های خونخورده میکنند. علایمی نیز روزهای بعد از مرگ مشاهده شد که بر طبق گونه های قارچی متفاوت بود. پس از توسعه و گسترش قارچ در داخل بدن کنه سویه های متاریزیوم فلاوویریده و متاریزیوم آنیزوپلیه از طریق کوتیکول و از سطح پشتی و شکمی کنه های مرده بیرون میآیند و تشکیل کنیدیوفور را میدهند ]25,26.[

فصل سوم

مواد و روش کار

3-1- کنهها

3-1-1- تهیه کلنی کنهها:

3-1-2- حمل و نقل کنه ها:
برای انتقال کنه ها از جعبه های کوچک ترجیحا مقوایی که دارای سوراخ های کوچکی به منظور تهویه هوا می باشند استفاده گردید. اگر مسافت حمل و نقل طولانی باشد برای تامین رطوبت کنه ‏ها لازم است آنها را بین دو لایه حوله کاغذی که اندکی رطوبت دارد نگهداری نمود تا از صدمات احتمالی ناشی از رطوبت جلوگیری شود. اکثر مشکلات زمانی بروز می‏کند که کنه ها در شرایط بسیار خشک و یا خیس که ناشی از زمان طولانی حمل و یا درجه حرارت نامناسب می‏باشد نگهداری شوند. کنه ها را نباید در بستههای سر بسته بدون امکان جابجایی هوا، جعبههای پلاستیکی و یا لوله های شیشهای گذاشت هم چنین کنه ها را نباید روی پشم و یا پنبه قرار داد و بسته های حاوی آن نباید در معرض حرارت زیاد و یا نور خورشید قرار گیرند] 17.[

3-1-3- کار با کنه ها در آزمایشگاه:
آن دسته از کنه ها که دارای تحرک و رنگ طبیعی بودند برای انجام آزمایش انتخاب گردیدند. این کنه ها در الکل 70 درجه غوطه ور شدند تا استریل شوند و از آلودگی بعدی جلوگیری شود. برای نگهداری کنه ها از یک دستگاه ژرمیناتور مناسب که دارای رطوبت 85-75 % و درجه حرارت 28-27 درجه سانتی گراد است استفاده گردید.

3-2- قارچ ها

3-2-1- محیط کشت PDA:
در بررسی حاضر از تعدادی پلیت 100 میلیمتری حاوی محیط کشت سیب زمینی دکستروز آگار (Potato Dextrose Agar) استفاده گردید. برای تهیه این محیط ابتدا یک لیتر آب مقطر در یک ارلن ریخته و تا نزدیک نقطه جوش حرارت داده شد. بعد از انداختن یک عدد مگنت داخل آن، مقدار 5/39 گرم از پودر PDA به آن اضافه گردید. مخلوط حاصل روی هات پلیت (Hot plate) قرار گرفت، تا هم زمان با حرارت ملایم، چرخش مگنت پودر را کاملا در آب حل نماید و محیطی یکنواخت حاصل شود. برای جلوگیری از آلودگی باکتریایی، پس از اضافه کردن پودرPDA ، 05/0گرم پودر کلرامفنیکل وزن و در cc10 الکل اتیلیک حل و به محیط اضافه گردید. پس از اینکه پودرPDA و کلرامفنیکل با حرکات سریع مگنت در آب مقطر حل و محیطی شفاف حاصل شد، درب ارلن با فویل آلومینیومی بسته و با رعایت شرایط لازم، داخل اتوکلاو قرار گرفت. پس از اتمام اتوکلاو، محلول برای مدتی در شرایط محیط قرار گرفت تا سرد شود. سپس سطح میز با پنبه الکل استریل شد و در کنار شعله اقدام به پخش محلول آماده در پلیت‏های استریل گردید. بعد از منعقد شدن محیط، پلیتها جمعآوری و در بستههای پلاستیکی در یخچال 4 درجه سانتیگراد قرار گرفتند تا در مواقع لزوم بر روی آنها قارچ ‏های مورد مطالعه شوند.

مطلب مشابه :  پایان نامه تحلیل تفاوت ها ، اشتراکات و تناقضات میان حقوق داخلی و قواعد حاکم بر موافقتنامه عمومی تجارت خدمات

3-2-2- قارچ های مورد نیاز

3-2-2-1- تهیه قارچ ها:
چهار جدایه بومی از قارچ متاریزیوم آنیزوپلیه، از موسسه تحقیقات آفات و بیماریهای گیاهی وزارت جهاد کشاورزی تهیه گردید. مشخصات قارچهای مورد استفاده در جدول 3-1 آمده است.

جدول 3-1: جدایه های قارچی مورد استفاده در این مطالعه

غلظت مورد استفاده
محل
میزبان
جدایه
قارچ
107×4/2
109×4/2
1011×4/2

رشت
کرم ساقه خوار برنج
IRAN437C

متاریزیوم آنیزوپلیه
107×4/2
109×4/2
1011×4/2

اهواز
ملخ
IRAN715C
متاریزیوم آنیزوپلیه
107×4/2
109×4/2
1011×4/2

سراوان
سوسک سرخرطومی حنایی خرما
DEMI001
متاریزیوم آنیزوپلیه
107×4/2
109×4/2
1011×4/2

نور

M14
متاریزیوم آنیزوپلیه

3-2-2-2- کشت قارچ ها:
جهت کشت قارچ ها در شرایط استریل ابتدا سطح میز با پنبه الکل تمیز شد، سپس در کنار شعله به وسیله آنس فلزی مقداری از پرگنه های محیط منبع به محیط کشت منتقل شد. به این صورت از هر جدایه تعدادی کشت تهیه شد. کشتها برای 14 روز در انکوباتور 25 درجه نگهداری شدند، و از نظر رشد قارچ مورد بررسی قرار گرفتند.

3-2-2-3- تهیه سوسپانسیون کنیدیوم:
برای تهیه سوسپانسیون کنیدیومی، سطح محیط های کشت توسط آب مقطر همراه با توئین 80 (Tween 80) با غلظت 01/0 درصد شستشو داده شد. توئین 80 با کاهش کشش سطحی، باعث میشود کنیدیوم ها از محیط راحت تر جدا شوند. برای این منظور ابتدا سطح میز با پنبه الکل تمیز شد، سپس در کنار شعله مقدار کمی محلول توئین 80 در یکی از پلیت ها ریخته و سطح محیط کشت با استفاده از پیپت پاستور استریل که با حرارت مجرای آن بسته شده بود تراشیده و شستشو گردید. همین سوسپانسیون روی محیط دیگر ریخته شد و عمل تکرار شد. سوسپانسیون حاصله از 4 لایه گاز استریل گذرانده شد تا قطعات میسلیومها جدا شوند. از محلول صاف شده با استفاده از سمپلر یا پیپت پاستور برداشت و با استفاده از لام هموسیتومتر (نئوبار) اقدام به شمارش اسپور ها جهت تهیه رقت پایه (107 ×4/2 کنیدی در میلی‏لیتر) گردید.

3-2-2-4- تهیه اسلاید کالچر (Slide culture):
روش کشت روی لام برای کمک به شناسایی قارچ های رشتهای، که به سختی با روش تهیه تیزمانت شناسایی میشوند، انجام میشود. این روش در واقع روش مطمئنی برای تشخیص قارچ‏ های مختلف است چرا که بسیاری از قارچ ها را با توجه به شکل آنها در محیط های کشت و رنگ کلنی و پرگنه ها نمیتوان تشخیص داد. جهت تهیه اسلاید کالچر به ازای هر جدایه قارچی یک عدد لام و تعدادی لامل و یک لوله شیشهای U و یا V شکل در داخل پتریدیش قرار داده و مجموعه در اتوکلاو 121 درجه به مدت 15 دقیقه گذاشته شد. سپس محیط کشت آماده، توسط اسکالپل استریل به مربعهای مساوی و کوچک، حدود یک سانتیمتر مربع بریده شد و یک عدد از این قطعات روی لامی قرار گرفت و این لام روی لوله شیشهای U شکل درون پتری دیش قرار گرفت، با استفاده از آنس با رعایت شرایط استریل در زیر هود و در کنار شعله از هر کدام از قارچ های کشت شده به طور جداگانه برداشت و روی اضلاع قطعات فوق الذکر تلقیح گردید و در مرحله بعد لامل با کمی اعمال فشار روی قطعات تلقیح شده با قارچها قرار داده شد. این عمل برای 4 جدایه انجام گردید و مقداری آب مقطر استریل برای حفظ رطوبت و جلوگیری از خشک شدن محیط، به کف ظروف پتری اضافه گردید. کشت ها به مدت 14 روز در انکوباتور 25 درجه نگهداری شدند، و طی این مدت به طور مرتب با استفاده لوپ از نظر رشد