قارچ بررسی شدند. پس از رشد و کنیدیوم زایی با استفاده از یک پنس، لامل موجود روی هر کدام از محیط ها به آرامی برداشته شد، یک قطره لاکتوفنل کاتن بلو روی لام دیگری قرار گرفت و لامل به آرامی روی لاکتوفنل به شکلی که حباب هوا تشکیل نشود قرار داده شد و سپس اقدام به مشاهده آنها در زیر میکروسکوپ گردید.

3-3- طرز آلوده کردن کنه ها با سوسپانسیون کنیدیوم قارچ:
کنه ها بلافاصله پس از رسیدن به آزمایشگاه در الکل اتیلیک70% ضد عفونی شدند. سالم بودن کنههای بالغ مهم بود و در اسرع وقت پس از جمع آوری مورد ارزیابی قرار گرفتند. کنه های صدمه دیده و تغییر رنگ داده حذف شدند. کنه های سالم دارای حرکت بودند و برای ارزیابی چنانچه کنه ها در زیر یک منبع نور قرار می گرفتند به سمت نور حرکت میکردند ]17.[
برای انجام آزمایش، سوسپانسیونی حاوی 107×4/2، 109×4/2 و 1011×4/2 کنیدیوم در هر میلی لیتر از هر کدام از 4 جدایه تهیه گردید و در یخچال با دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد.
برای هر جدایه قارچی سه گروه درمان (3 بارتکرار) از هر کنهی مورد آزمایش، در غالب گروههای 10 تایی کنه در نظر گرفته شد، هم چنین 30 عدد کنه به عنوان گروه کنترل منفی در سه گروه 10 تایی جای گرفتند که در مجموع تعداد 390 کنهی هیالوما مارجیناتوم بالغ مورد استفاده قرار گرفت.
در گروه های درمان، کنه ها به صورت انفرادی به وسیلهی پنس استریل 5-3 ثانیه در سوسپانسیون قارچی مربوطه و در گروه کنترل منفی نیز کنه ها 5-3 ثانیه در آب مقطر استریل همراه با توئین 80 بدون اسپور، غوطه ور شدند. پس از غوطه وری، کنه ها به پتریدیشهایی که حاوی کاغذ صافی (کاغذ واتمن) مرطوب بود منتقل گردیدند. سپس در ژرمیناتور با دمای 25 درجه سانتیگراد و رطوبت 70 درصد قرار گرفتند. لازم به ذکر است کاغذ های واتمن قبل از استفاده اتو کلاو شدند و هر روز پس از مطالعه کنه ها چند قطره آب مقطر استریل به کف ظروف جهت تامین رطوبت اضافه گردید.
تمامی گروه های مورد آزمایش به صورت روزانه، به مدت 20 روز مورد مشاهده و بازبینی قرار گرفتند و تلفات و رشد قارچ روزانهی آنها ثبت شد.

3-4- روش آنالیز اطلاعات بدست آمده:
متوسط درصد آلودگی و تلفات کنه هیالوما مارجیناتوم در مطالعه حاضر در یک طرح خرد شده با در نظر گرفتن اثرات اصلی هفته، نوع قارچ، غلظت قارچ و تداخل سه طرفه با کمک رویه GLM (General linear Model) مورد آنالیز واریانس (Analysis at variance) دوطرفه قرار گرفت. تست توکی (Tukey) برای مقایسه میانگین ها مورد استفاده قرار گرفت. نتایج به صورت حداقل مربعات میانگین و خطای معیار میانگین بیان شد. مقادیر05/0?p به عنوان معنادار تلقی گردید. نرم افزار آماری SAS (Statistical Analysis system) برای تخمین اطلاعات مورد استفاده قرار گرفت.

فصل چهارم

نتایج حاصل از آزمایش پایلوت بر روی کنه بالغ هیالوما مارجیناتوم:

ازآنجایی که هیچ گونه اطلاعی از اثرقارچ ها بر روی کنه هیالوما مارجیناتوم وجود نداشت تستی مقدماتی و غربالگری انجام گردید تا قارچ های با اثر کشندگی بهتر انتخاب گردند و از کاربرد قارچ ها با اثر ناچیز و حتی بی اثر بر روی کنه جلوگیری گردد. چرا که در غیر اینصورت با در نظر گرفتن 3 رقت برای هر جدایه و تکرار آن به شکل سه بار تکرار در شرایطی که بنا بود 10 کنه در هر پتری پلیت استفاده گردد برای هر جدایه قارچ حدود 90 کنه نیاز بود بنابراین با در نظر گرفتن گروه های کنترل حدود 450 کنه برای مطالعه می بایست مورد استفاده قرار گیرد که مطالعه میزان اثر جدایه ها و تعیین مرگ و میر کنه ها در اثر این قارچ ها به شکل سه بار تکرار و غلظت های گوناگون عملا از لحاظ کشت و جمع آوری کنه و مطالعه غیر ممکن بود بنابراین در این مرحله حد اکثر سوسپانسیون قارچی شامل 1011×4/2 اسپور در هر میلی لیتر برای هر جدایه قارچی و 5 کنه برای مطالعه هر جدایه در نظر گرفته شد تا میزان مرگ و میر کنه ها و به عبارتی بیماریزایی هر کدام از جدایه های قارچی توسط شناور کردن 5 کنه هیالوما مارجیناتوم بالغ که قبل از آغشته کردن با اسپور قارچی با الکل 70 در صد ضد عفونی و خشک گردیده بودند مشخص گردید. مدت این آغشته کردن 5-3 ثانیه بود و پس از این کنه ها در پتری دیش های استریل حاوی کاغذ صافی مرطوب قرار می گرفتند[25].دما و رطوبت حاصله توسط ژرمیناتور تهیه گردید البته جهت اطمینان از رطوبت کامل، پلیت ها در دسیکاتوری قرار گرفتند که در کف آن آب و نمک اشباع قرار داشت و دسیکاتور در ژرمیناتور قرار گرفت. برای تمام جدایه های قارچی یک گروه کنترل شامل 5 کنه بالغ به همان روش ذکر شده مورد درمان قرار گرفت، به جز این که کنه ها در آب مقطر استریل همراه با توئین آغشته گردیدند. مرگ و میر کنه ها به طور روزانه هر 24 ساعت یک بار مورد مطالعه قرار گرفت و ثبت گردید و کنه های تلف شده در اثر قارچ مشخص و این لاشه ها به ظروف دیگری منتقل گردید تا رشد و نمو قارچ بر روی آنها مورد مطالعه قرار گیرد[46].
طی این مطالعه تاثیر قارچی متاریزیوم آنیزوپلیه DEMI 001 ،M14 ، IRAN 437C، IRAN 715 C بررسی شد و تعداد 4 گروه پنج تائی از کنه های بالغ هیالوما مارجیناتوم مورد ارزیابی قرار گرفتند که در جدول 4-1 نشان داده شده است.

مطلب مشابه :  دانلود پایان نامه : بررسی نقش اکراه در جرائم مستلزم حد و قصاص

جدول 4-1: گروه های تحت درمان در اثر کنیدیوم های مختلف قارچی با غلظت 1011 ×4 /2 کنیدیوم در هر میلی لیتر

گونه
جدایه
درصد مرگ و میر 14روز پس از تلقیح
متاریزیوم آنیزوپلیه
IRAN437C
50
متاریزیوم آنیزوپلیه
IRAN715C
50
متاریزیوم آنیزوپلیه
DEMI001
100
متاریزیوم آنیزوپلیه
M14
100

نتایج حاصل از مطالعه مقدماتی نشان می دهد که قارچ های آزمایش شده حدتشان در برابر کنه های بالغ هیالوما مارجیناتوم متفاوت است و میزان مرگ و میر کنه های تحت درمان بین 100-0 درصد 14 روز پس از تلقیح کنه ها با غلظت 1011 ×4/2 کنیدیوم در هر میلی لیترگردید. ضمن این که مرگ و میر در گروه کنترل صفر درصد گردید. تمام کنه های تحت درمان 14 روز پس از تلقیح کنه ها با کنیدیوم های قارچی در اثر متاریزیوم آنیزوپلیه جدایه M14 و متاریزیوم آنیزوپلیه جدایه DEMI001 تلف گردیدند(جدول 1-5).

فصل پنجم

نتایج حاصل از آزمایش نهایی بر روی کنه بالغ هیالوما مارجیناتوم:

جدول5-1: گروه های تحت درمان در اثر غلظت های مختلف کنیدیوم های قارچی

گونه
جدایه
غلظت کنیدیوم در هر میلی لیتر
تکرار
تعداد
متاریزیوم آنیزیوپلیه
IRAN437C
107×4/2
3
30

109×4/2
3
30

1011×4/2
3
30

IRAN715C
107×4/2
3
30

109×4/2
3
30

1011×4/2
3
30

DEMI001
107×4/2
3
30

109×4/2
3
30

1011×4/2
3
30

M14
107×4/2
3
30

109×4/2
3
30

1011×4/2
3
30
کنترل

آب مقطر بدون اسپور
3
30
جمع

39
390

در ادامه پارامترهایی چون مرگ و میر کنه های بالغ در اثر قارچ (مشاهده میسیلیوم های قارچی روی سطح کنه مرده) تا 20روز پس از آلودگی مورد ارزیابی قرار گرفت که در جدول5 -3 نشان داده شده است.
درمدل مورد مطالعه میزان آلودگی تحت تاثیر قرار گرفته بود( 0001/0= P ). این اثر ناشی از تغییرات روزانه میزان آلودگی بوده است(0001/0? P).به طوری که الگوی تغییرات آلودگی در روزهای مختلف آزمایش تابعی از غلظت قارچ مورد استفاده بوده است(0014/0= P). بر این اساس نوع قارچ تاثیری بر روی میزان رشد قارچ نداشته باشد(9016/0= P ).
جدول 5-2 متوسط در صد میزان آلودگی* کنه هیالوما مارجیناتوم با غلظت های مختلف کنیدیوم در طی سه هفته مورد مطالعه(LSmean).
4/2×1011
4/2×109
4/2×107
غلظت
هفته
65bB
5/37aA
3/43bA
هفته اول
18aA
35aA
7/31cbA
هفته دوم
8/0aA
2/4bA
15acA
هفته سوم
8/15aA
2/19abA
8/5 aA
کنه آلوده نشده
داده های واجد حداقل یک حرف مشترک (abc) در هر ستون دارای اختلاف معنا دار نمی باشد (05/0?p). داده های واجد حداقل یک حرف مشترک (ABC) در هر ردیف دارای اختلاف معنا دار نمی باشد (05/0?p).
*خطای معیار میانگین در جدول برابر با 54/6 می باشد.
در غلظت 107×4/2 میزان آلودگی 94 درصد را نشان می دهد که بیشترین میزان آلودگی در هفته اول و دوم بود. در غلظت 109×4/2 میزان آلودگی کنه ها 81 درصد بود که بیشترین میزان آلودگی در هفته اول و دوم بود. در غلظت 1011×4/2 میزان آلودگی کنه ها 84 درصد بوده است که بیشترین میزان آلودگی در هفته اول بوده است(جدول 5-2).

جدول 5-3 متوسط در صد میزان آلودگی* کنه هیالوما مارجیناتوم پس از آلودگی با غلظت های مختلف قارچ های مختلف در طی سه هفته مورد مطالعه(LSmean).
4/2×1011
4/2×109
4/2×107
غلظت
جدایه قارچی
هفته سوم
هفته دوم
هفته اول
هفته سوم
هفته دوم
هفته اول
هفته سوم
هفته دوم
هفته اول

مطلب مشابه :  پایان نامه مطالعه تطبيقي عزل ولي قهري در فقه امامیه

0aABC
3/23aA
70aBA
10aA
30aA
30aA
3/23aA
3/43aA
3/33aA
DEM001
0aBA
3/3aBA
7/76aABC
7/6aBA
50aA
40aA
20aA
3/23aA
3/53Aa
IRAN437
0aBA
20aA
7/56aABC
0aBA
3/23aA
3/43aA
0aBA
20aA
3/53aA
IRAN715
3/3aAD
7/26aAC
7/56aAC
0aAB
7/36aA
7/36aA
7/16aA
40aA
33aA
M14
داده های واجد حداقل یک حرف مشترک (abc) در هر ستون دارای اختلاف معنا دار نمی باشد (05/0?p). داده های واجد حداقل یک حرف مشترک (ABC) در هرردیف دارای اختلاف معنا دار نمی باشد (05/0?p).
*خطای معیار میانگین در جدول برابر با 08/13 می باشد.
جدول 5-4 متوسط در صد *کنه هیالوما مارجیناتوم آلوده نشده پس از در معرض قرارگیری با غلظت های مختلف قارچ های مورد مطالعه
4/2×1011
4/2×109
4/2×107
غلظت
جدایه قارچی
6/6aA
30aA
0aA
DEMI001
20aA
3/3aA
3/3aA
IRAN437
23aA
3/33aA
10aA
IRAN715
3/13aA
6/26aA
10aA
M14
داده های واجد حداقل یک حرف مشترک (abc) در هر ستون دارای اختلاف معنا دار نمی باشد (05/0?p). داده های واجد حداقل یک حرف مشترک (ABC) در هرردیف دارای اختلاف معنا دار نمی باشد (05/0?p).
*خطای معیار میانگین جدول 08/13 می باشد.
بیشترین در صد کنه های آلوده شده در هفته اول و در غلظت 1011×4/2 بوده است (05/0? P) و بیشترین در صد آلودگی در هفته دوم و در غلظت 109×4/2 محاسبه گردید (35 درصد). بیشترین میزان آلودگی در هفته سوم در غلظت 107×4/2 بوده است (15درصد).
مطابق جدول 5-3 جدایه متاریزیوم آنیزوپلیه DEMI001 در غلظت های 107×4/2، 109×4/2 و 1011×4/2 کنیدیوم در هر میلی لیتر به ترتیب 100، 70 و 4/93 درصد کنه ها آلوده شدند و این جدایه در غلظت 107×4/2 کنیدیوم در هر میلی لیتر بیشترین آلودگی را در هفته دوم داشت. در غلظت 109×4/2 کنیدیوم در هر میلی لیتر میزان آلودگی در طی سه هفته یکنواخت بود. در غلظت 1011×4/2 کنیدیوم در هر میلی لیتر بیشترین میزان آلودگی مربوط به هفته اول بود.
در مورد جدایه IRAN437c در غلظت های 107×4/2، 109×4/2 و 1011×4/2 کنیدیوم در هر میلی لیتر به ترتیب 7/96، 7/96 و 80 درصد کنه ها آلوده شدند. و بیشترین درصد آلودگی در غلظت 107×4/2 کنیدیوم در هر میلی لیتر مربوط به هفته اول و در غلظت 109×4/2 کنیدیوم در هر میلی لیتر باعث آلودگی کنه ها در طی سه هفته به طور یکنواخت بود (جدول 5-3).
در مورد جدایه IRAN715C در غلظت های 107×4/2، 109×4/2 و 1011×4/2 کنیدیوم در هر میلی لیتر به ترتیب 3/73، 7/66 و 77 درصد کنه ها آلوده شدند و بیشترین درصد آلودگی در غلظت 107×4/2 کنیدیوم در هر میلی لیتر مربوط به هفته اول و در غلظت 109×4/2 و 1011×4/2 کنیدیوم در هر میلی لیتر مربوط به هفته اول بود(جدول 5-3).
در مورد جدایه M14 در غلظت های 107×4/2، 109×4/2 و 1011×4/2 کنیدیوم در هر میلی لیتر به ترتیب باعث آلودگی 90، 4/73 و 7/86 درصد کنه ها شدند که بیشترین درصد آلودگی در غلظت 107×4/2 کنیدیوم در هر میلی لیتر مربوط به هفته دوم و در غلظت 109×4/2 کنیدیوم در هر میلی لیتر در طی سه هفته به طور یکنواخت بود و در غلظت 1011×4/2 کنیدیوم در هر میلی لیتر بیشترین درصد آلودگی مربوط به هفته اول بود (جدول 5-3).
جدول5-4 نشان می دهدکه متوسط در صد کنه های باقیمانده در هفته های مختلف قارچ های مورد مطالعه واجد اختلاف معنادار نبوده است (05/0?p).

در مدل مورد مطالعه میزان تلفات حاصل از آلودگی دارای اختلاف معنی داری نبود (2773/0 p=) اما میزان تلفات در هفته های مختلف جمع آوری دارای اختلاف معنی داری بود (0062/0=p). این اثر بیشتر ناشی از زمان بروز تلفات بود (0001/0?p). به طور کلی غلظت (9571/0=p) و نوع قارچ (9813/0=p) اثر معنی داری بر روی میزان تلفات حاصل از آلودگی نداشت.
جدول 5-5 متوسط درصد تلفات * کنه هیالوما مارجیناتوم پس از در معرض قرارگیری با قارچ های مورد مطالعه در طی هفته های پس از آلودگی
M14
IRAN715
IRAN437
DEMI001
جدایه قارچی
هفته
20bA
6/26aA
30aA
7/27aCA
هفته اول
3/13bA
8/18abA
5/15abA
2/12bCA
هفته دوم
2/12bA
6/6bAB
3/13bA
5/25aCA
هفته سوم
8/48aA
2/42aA
1/41aA
4/34aA
باقیمانده
داده های واجد حداقل یک حرف مشترک (abc) در هر ستون دارای اختلاف معنا دار نمی باشد (05/0?p).
داده های واجد حداقل یک حرف مشترک (ABC) در هرردیف دارای اختلاف معنا دار نمی باشد (05/0?p).
*خطای معیار میانگین جدول 63/6 می باشد.
میزان تلفات