مقاله رایگان با موضوع پلی، پرایمر، سانتی

نسخه برداری یک الگوی DNA در چرخه های مکرر همانند سازی است و با استفاده از آن می توان به مقادیر زیادی DNA یکسان دسترسی پیدا کرد (میرمومنی و وطن دوست، 1384).
برای انجام PCR، DNA پلی مراز، نوکلئوتید تری فسفات ها و پرایمر لازم است (امتیازی، 1386).
4-4-2 آنزیم های PCR:
روش PCR با استفاده از آنزیم DNA پلی مراز پایدار در برابر حرارت (Taq پلی مراز) که از باکتری گرمادوست به نام Thermusaquaticus به دست آمده است و ماشین هایی که به طور اتوماتیک، حرارت ضروری برای هر چرخه را در PCR فراهم می سازند، تسهیل شده است. Taq پلی مراز، آنزیمی مناسب است، زیرا در چرخه های حرارت بالا (94 درجه سانتی گراد) فعال باقی می ماند و همچنین دمای اپتیمم عمل آن نیز 72 درجه سانتی گراد می باشد و می تواند فرآورده های عالی و کافی از DNA های کوتاه را فراهم کند. ضمناً با افزودن یک بار آنزیم Taq پلی مراز دیگر نیازی به اضافه کردن مجدد آن نمی باشد (نوروزی، 1383؛ امتیازی، 1386).
مزیت بسیار مهم دیگر Taq پلی مراز، افزایش حساسیت و دقت PCR می باشد. در دمای پایین (30 درجه سانتی گراد)، پرایمرها ممکن است به جایگاه هایی که توالی تا حدودی مشابه دارند نیز متصل شوند، زیرا در دمای پایین تعداد کمتری پیوند هیدروژنی برای اتصال پرایمرها لازم است. بنابراین پرایمرها با اتصال به نواحی نسبتاً مشابه باعث ایجاد اشتباه در مراحل PCR می شوند. ولی وقتی واکنش در دمای 72 درجه سانتی گراد انجام شود اتصال پرایمرها به نواحی غیر از ناحیه اصلی کاهش می یابد. به این ترتیب بعد از پایان PCR، رشته های DNA کاملا” مشابه و خالص به دست خواهند آمد (امتیازی، 1386).
5-4-2 پرایمرهای PCR:
اختصاصی بودن روش PCR، به استفاده از پرایمرهای الیگونوکلئوتید سنتزی بستگی دارد. پرایمرها، قطعات کوتاهی از زنجیر مفرد DNA (bp15 تا bp30) بوده که برای تولید یک مولکول دارای توالی خاص نوکلئوتیدی سنتز شده اند (نوروزی، 1383). از آن جایی که DNA دو رشته ای است، دو نوع پرایمر در PCR مورد نیاز است (امتیازی، 1386). دو پرایمر R53 و F54 معمولاً به کار می روند که هر کدام توالی های متفاوتی دارند. به طوری که توالی پرایمرها، مکمل توالی هایی هستند که در زنجیر DNA الگو قرار دارند (نوروزی، 1383). این دو پرایمر علاوه بر نقش اصلی خود در شروع سنتز DNA، در تعیین محل ژن تکثیر شونده و همچنین تعیین اندازه قطعات تکثیر شونده نقش دارند (میرمومنی و وطن دوست، 1384).
6-4-2 روش انجام PCR:
برای شروع PCR، DNA الگو، پرایمرها، نوکلئوتید تری فسفات ها و DNA پلی مراز در یک لوله با هم مخلوط می شوند. سپس لوله را گرم می کنند تا دو رشته DNA از هم جدا شوند. سپس لوله را سرد می کنند تا پرایمرها به نواحی مورد نظر متصل شوند و DNA پلی مراز شروع به همانند سازی از روی DNA نماید. بعد از مدت زمان لازم برای همانند سازی بار دیگر سیستم گرم می شود تا باز رشته ها از هم جدا شوند و دوباره سیستم سرد می شود تا بار دیگر پرایمرها به نواحی مکمل خود متصل شوند. چوون در مرحله قبل رشد DNA در ناحیه مورد نظر مضاعف شده بود، در این مرحله چهار رشته الگو برای همانند سازی وجود دارد و در نتیجه در پایان این مرحله، چهار نسخه از ژن مورد نظر حاصل می شود. بار دیگر سیستم گرم می شود و در این جا هشت نسخه به وجود می آید و در مرحله بعد 16 نسخه و به همین صورت به طور تصاعدی تعداد نسخه های ژن ها زیاد می شود. به طور کلی پس از n تکرار، ما در محلول، نسخه از ژن مورد نظر را خواهیم داشت (امتیازی، 1386).
برنامه حرارتی PCR به صورت زیر تنظیم می شود:
1. مرحله باز شدن زنجیره DAN55
2. مرحله اتصال پرایمرها به توالی هدف56 در 55 الی 62 درجه سانتی گراد
3. مرحله ساخت زنجیره مکمل 57 هدف در 72 درجه سانتی گراد
4. مرحله پایداری58 در 72 درجه سانتی گراد
5. مرحله پایانی در 4 درجه سانتی گراد (نوروزی، 1383).
7-4-2 کاربردهای PCR:
به طور کلی PCR به دو منظور اصلی به کار می رود:
1. تهیه نسخه های متعدد از یک ژن
2. بررسی حضور یا عدم حضور یک ژن خاص در یک قطعه DNA
کاربردهای دیگر شامل موارد زیر می باشد:
بررسی پیوستگی ژن ها، میزان جهش ها، تعیین فاصله بین ژن ها بر روی کروموزوم های انسان، تشخیص قبل از تولد بیماری های ژنتیکی، تعیین جنسیت جنین، بررسی عفونت های باکتریایی و ویروسی، تعیین سرطان ها، تعیین توالی های کروموزومی انسان در سلول های هیبریدی، تولید DNA نوترکیب و غیره (امتیازی، 1386).
8-4-2 مشکلات و موانع PCR:
1. اشتباه در همانند سازی در سیستم PCR قابل اصلاح نیست. به طوری که مثلا”Taq پلی مراز تقریبا در هر 10×2 نوکلئوتید، مرتکب یک اشتباه می شود. استفاده از تعداد بیشتر رشته های الگو و کاهش تعداد مراحل تکرار PCR، باعث کاهش اشتباهات در PCR می شود (میرمومنی و وطن دوست، 1384).
2. مشکل مهم دیگر آلودگی نمونه های مورد بررسی است. به دلیل حساسیت فوق العاده و قدرت تکثیر زیاد PCR، هر قطعه DNA خارجی که وارد محیط PCR شود، مورد تکثیر قرار گرفته و نتایج عجیب و دور از واقعیتی را به وجود خواهد آورد. گاهی نیز باقی مانده قطعات DNA حاصل از تکثیر DNA های قبلی باعث آلودگی PCR می شود که در این مورد، شستشوی زیاد و دقیق مشکل گشا است (امتیازی، 1386).
9-4-2 انواع مختلف PCR:
علاوه بر PCR معمولی، چندین روش اصلاح شده PCR وجود دارد که در این جا فقط به تعداد معدودی از آن ها اشاره می شود:
1. PCR چندتایی59: در این روش از چندین جفت پرایمر اختصاصی جهت اهداف های مختلف در یک واکنش PCR استفاده می شود. هدف از این روش:
– بخش های بزرگی از DNA هدف می تواند مورد بررسی قرار گیرد.
– بخش های غیر مربوط به هم در DNA هدف نیز می تواند مورد جستجو قرار گیرد.
– با پرایمرهای مختلف بر روی یک نمونه می توان به جستجوی عوامل مختلفی پرداخت و اطلاعات بیشتری به دست آورد.
2.RT-PCR60: چنان چه اسیدنوکلئیک هدف از نوع RNA باشد مانند برخی ویروس ها، می توان از RT-PCR استفاده کرد. در این روش ابتدا RNA با استفاده از آنزیم ترنس کریپتاز وارونه61 استخراج شده و cDNA تبدیل می شود. سپس cDNA ساخته شده در اثر یک تغییر ساده در شرایط بافری (با افزودن EGTA) با روش PCR تکثیر می یابد.
3. آرمز PCR62: روشی قدرتمند برای مشخص کردن جهش های نقطه ای است. در این روش از پرایمرهای نوع جهش یافته و نوع طبیعی در دو لوله جداگانه استفاده می شود.
4. نستد PCR63: در این روش از دو جفت پرایمر استفاده می شود که جفت دوم پرایمر در جفت اولی پرایمر جای دارد (نوروزی، 1383).

مطلب مشابه :  منبع مقاله با موضوعپلیمر، پلیمرهای، هادی

Author: y7oozita

دیدگاهتان را بنویسید