منابع پایان نامه ارشد درمورد میلی، کنیم، میکرولیتر، باکتری

دانلود پایان نامه

و 5 الی 10 دقیقه روی یخ نگه می داریم .
5- میکروتیوب ها را 3 دقیقه در 900 دور سانتریفیوژ می کنیم.
6- مایع روئی را دور ریخته و رسوب باکتری را در یک میلی لیتر محلول استریل 1/0 مولار کلرید کلسیم حل می کنیم .
7- 20 تا 30 دقیقه محلول مذکور را روی یخ انکوبه می کنیم .
8- این بار رسوب را در 600 میکرولیتر محلول کلرید کلسیم استریل 1/0 مولار حل می کنیم .
9- 20 تا 30 دقیقه محلول را روی یخ انکوبه می کنیم.
10- سپس محلول را به مدت 3 دقیقه در9000 دور سانتریفیوژ می کنیم .
11- رسوب را در 300 میکرولیتر محلول کلرید کلسیم استریل حل میکنیم.
12- به مدت 20 دقیقه محلول را بر روی یخ قرار می دهیم.
این باکتری ها تا 72 ساعت روی یخ رد یخچال قابل نگهداری می باشند و می توان با افزودن گلیرول استریل 30 درصد آن ها را در 70- درجه سانتیگراد به مدت چند ماه نگهداری کرد .

3-5-3-2 ترانسفورماسیون سلول های شایسته E.coli BL21(DE3) با محصول لایگیشن به روش شوک حرارتی
مراحل انجام کار به صورت زیر است:
1- ابتدا 100 میکرولیتر از سلول های مستعد E.coli BL21(DE3) را روی یخ ذوب می کنیم.
2- 30 میکرولیتر از محصول لایگیشن را به 100 میکرولیتر از سلول های مستعد اضافه می کنیم به طوری که کاملا با هم مخلوط شوند.
3- این مخلوط را به مدت 30 دقیقه بر روی یخ انکوبه می کنیم.
4- نمونه ها را به مدت 90 ثانیه در بن ماری 42 درجه سانتیگراد قرار می دهیم و بلافاصله به روی یخ منتقل می کنیم و 5 دقیقه اجازه می دهیم بدون حرکت روی یخ بماند.
5- مخلوط فوق را به 900 میکرولیتر از محیط LB فاقد کانامایسین افزوده و آن را به مدت 5/1 ساعت در شیکر انکوباتور 37 درجه قرار می دهیم تا باکتری های ترانسفورم شده بتواند شروع به تکثیر نمایند.
6- مخلوط فوق را به مدت 3 دقیقه در 9000 دور سانتریفیوژ می کنیم .
7- 800 میکرولیتر از مایع روئی را دور ریخته و رسوب را در 230 میکرولیتر باقی مانده، به خوبی حل می کنیم .
8- 230 میکرولیتر را روی یک پلیت حاوی LB آگار کانامایسین دار ریخته و کشت سه قسمتی می دهیم ، اجازه می دهیم کاملا جذب محیط شده و سپس آن ها را به مدت 18 تا 20 ساعت در انکوباتور 37 درجه نگهداری می کنیم .

3-5-4 ارزیابی کلونی ها
پس از انکوباسیون در 37 درجه سانتیگراد اندازه کلونی ها به حدود 1 تا 2 میلی متر می رسد . یک تک کلونی را جدا کرده و در 5 میلی لیتر LB براث کانامایسین دار تلقیح می نمائیم و به مدت یک شب در 37 درجه و با سرعت مناسب شیکر انکوبه می نمائیم . با رشد باکتری در این محیط تایید می شود که باکتری Bl21(DE3) ، پلاسمید بیانی pet-28a حاوی ژن ما را دریافت کرده است .

3-5-5 استخراج پلاسمید بیانی pet-28a حاوی ژن مولتی توپ EpCAM
جهت تایید وجود پلاسمید pet-28a در باکتری و عدم وجود هرگونه الودگی در محیط کشت نیاز است که وجود پلاسمید مورد نظر تایید شود، بدین منظور از محیط کشت حاوی باکتری ترانسفورم شده BL21(DE3) استخراج پلاسمید صورت گرفت. مراحل انجام کار بصورت زیر است:
1- از محیط کشت حاوی باکتری ترانسفورم شده که به مدت یک شبانه روز در دمای 37 درجه انکوبه شده است و کاملا بصورت کدر درآمده است ، 5/1 میلی لیتر جدا کرده و داخل میکروتیوب 5/1 می ریزیم.
2- سپس به مدت 3 دقیقه در 9000 دور سانتریفیوژ می کنیم .
3- محیط روئی را دور ریخته و باکتری در ته میکروتیوب رسوب می کند .
* نکته: برای استخراج غلظت بالاتری از پلاسمید می توان مراحل قبل را تکرار کرد.
4- در این مرحله 250 میکرولیتر از بافر محلول کننده که دارای RNAase است به رسوب باکتری اضافه کرده و مخلوط را کاملا هم می زنیم تا رسوبی در ته میکروتیوب باقی نماند و تمامی آن در حلال حل شود.
5- 250 میکرولیتر از محلول لیزکننده به مخلوط اضافه می کنیم سپس آن را 4 تا 6 بار سروته می کنیم تا کاملا مخلوط شود . این بافر کاملا باکتری را لیز می کند.
6- در مرحله ی بعد 350 میکرولیتر از بافر خنثی کننده به مخلوط مرحله قبل اضافه می کنیم . سپس سریعا میکروتیوب را چند بار سر و ته می کنیم تا باکتری های لیز شده به حالت ابری شکل لخته شوند.
7- سپس به مدت 5 دقیقه در 9000 دور محلول را سانتریفیوژ کرده تا قطعات باکتری رسوب کنند.
8- محلول روئی را نگه داشته و رسوب را دور می ریزیم.
9- محلول روئی به ستون استخراج پلاسمید منتقل می کنیم . این ستون حاوی سیلیکا است که پلاسمید را جذب می کند.
10- ستون حاوی محلول را به مدت 1 دقیقه در 12000 دور سانتریفیوژ می کنیم .
11- محلول روئی را دور می ریزیم.
12- به ستون 500 میکرولیتر بافر شستشو اضافه می کنیم .
13- به مدت 45 ثانیه در 000/12 دور ستون را سانتریفیوژ می کنیم .
14- مرحله قبل را یکبار دیگر تکرار می کنیم .
15- محلول درون ستون را دور می ریزیم.
16- ستون را به مدت 1 دقیقه دیگر در 000/12 دور سانتریفیوژ می کنیم تا الکل موجود در بافر شستشو که در مرحله ی قبل مورد استفاده قرار گرفت کاملا از ستون خارج شود زیرا الکل مانع واکنش های آنزیمی می باشد.
17- ستون را درون یک میکروتیوب 5/1 قرار می دهیم و سپس بافر جدا کننده را به میزان 50 میکرولیتر به ستون اضافه می کنیم . بافر جدا کننده دقیقا باید بر روی سیلیکا ریخته شود. 2 الی 3 دقیقه در دمای اتاق ستون را نگه می داریم تا بافر کاملا به سیلیکا نفوذ کند.
18- به مدت 2 دقیقه در 000/12 دور ستون را در درون میکروتیوب5/1 سانتریفیوژ می کنیم .
19- ستون را دور ریخته و محلول درون میکروتیوب حاوی پلاسمید استخراج شده است.

مطلب مشابه :  پایان نامه رایگان دربارهدینامیکی، نمونه برداری، مبانی نظری

3-5-6 تایید انزیمی پلاسمید استخراج شده
بعد از استخراج پلاسمید بیانی pet-28a که حاوی ژن مولتی توپ EpCA
M انتقال داده شده به ان به کمک تکنیک لایگیشن است وتایید وجود ان، با توجه به جایگاههای آنزیمی در نظر گرفته شده در ابتدا و انتهای ژن مولتی توپ EpCAM می توان از آن ها جهت تایید حضور ژن در پلاسمید استفاده کرد و سپس محصول هضم آنزیمی دوگانه جهت بررسی بر روی ژل آگارز بوده تا قطعات مورد نظر مربوط به پلاسمید و ژن سنتز شده مشاهده شوند.

3-5-6-1 هضم آنزیمی دوگانه یا Double digestion و الکتروفورز
مراحل انجام کار به شکل زیر است:
1- یک میکروتیوب 2/0 برمی داریم و محتویات واکنش را به صورت زیر در آن مخلوط می کنیم .
* آب استریل: 12 میکرولیتر
* بافر تنگو x2 : 4 میکرولیتر
* آنزیم NcoI : 1 میکرولیتر
* آنزیم XhoI : 1 میکرولیتر
* پلاسمید pet-28a نوترکیب: 2 میکرولیتر
حجم نهایی واکنش:20 میکرولیتر
2- میکروتیوب را به مدت 1 الی2 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد ( دمای اپمتیوم واکنش آنزیم ها ) قرار می دهیم .
3-الکتروفورز انجام داده تا قطعات پلاسمید و ژن مولتی توپ EpCAM شناسایی وتایید شوند.

3-6 بیان پروتئین مولتی توپ EpCAM
پس از تائید ترانسفورماسیون و وجود پلاسمید حاوی ژن مولتی توپ EpCAM در باکتری میزبان، با توجه به پروموتر lac در پلاسمید pet-28a ، جهت القاء بیان پروتئین در باکتری از القاگر IPTG در رقت مناسب استفاده شد.

3-6-1 القاء بیان پروتئین به کمک IPTG
مراحل کار بصورت زیر می باشد:
1) به 2 میلی لیتر از محیط کشت LB حاوی انتی بیوتیک کانامایسین ، ? 20 از باکتری BL21(DE3) ترانسفورم شده اضافه شد و به مدت یک شب در شیکر انکوباتور 37 درجه سانتیگراد و با سرعت rpm 150 قرار داده شد و به ان اجازه دادیم تا رشد کند.
2) ? 20 از مخلوط مورد نظر به 2 میلی لیتر از محیط کشت LB تازه حاوی انتی بیوتیک کانامایسین اضافه شد و به مدت 2 ساعت در شیکر انکوباتور 37 درجه سانتیگراد با سرعت rpm 150 قرار داده شد تا غلظت باکتری مورد نظر به OD به 8/0 برسد. بدین طریق باکتری ها تازه گشته و در فاز لگاریتمی خود قرار دارند.
3) ? 20 از القاگر IPTG با غلظت 100 میکروگرم در میلی لیتر به 2 میلی لیتر از محیط کشت حاوی باکتری ترانسفورم شده اضافه شد و سپس به مدت 6 ساعت در شیکر انکوباتور 37 درجه سانتیگراد با سرعت rpm 150 قرار داده شد.
* نکته: نمونه های کنترل منفی بدون افزوده شدن IPTG مورد بررسی قرار گرفتند.
4) مخلوط مورد نظر به مدت 5 دقیقه در 4 درجه و با سرعت rpm 5000 سانتریفیوژ شد.
5) محلول روئی را دور ریخته و به رسوب ان ? 60 اوره 8 مولار اضافه شد و به کمک تکنیک SDS-page بیان پروتئین مورد نظر مورد بررسی قرار گرفت.

3-6-2 بررسی بیان به کمک تکنیک SDS-page
به منظور جداسازی باند های پروتئینی سلولی و ردگیری پروتئین نوترکیب در سلول های ترانسفورم شده و نیز میزان بیان پروتئین مورد نظر از الکتروفورز بر روی ژل پلی اکریل امید استفاده شد و عصاره های سلولی تهیه شده بر روی SDS-page الکتروفورز شدند. با توجه به این که وزن مولکولی پروتئین نوترکیب حدود 15 کیلو دالتون می باشد از ژل %15 استفاده شد.

3-6-2-1 روش ساخت محلول ها و ژل ها
جهت تهیه ژل ها از مواد زیر استفاده شد:
1) ژل پائین یا ژل جدا کننده101
* H2O استریل : 1/1 میلی لیتر
* اکریل امید %30 : 2 میلی لیتر
* تریس 5/1 مولار ( 8/8 = PH ) : 1 میلی لیتر
* SDS %10 : 05/0 میلی لیتر
* امونیوم پرسولفات [ APS ] %10 : 05/0 میلی لیتر
* تترا متیل اتیلن دی امین [ TEMED ] : 01/0 میلی لیتر
2) ژل بالا یا ژل متراکم کننده102
* H2O استریل : 4/1 میلی لیتر
* اکریل امید %30 : 4/0 میلی لیتر
* تریس 5/0 مولار ( 8/6 = PH ) : 6/0 میلی لیتر
* SDS %10 : 05/0 میلی لیتر
* امونیوم پرسولفات [ APS ] %10 : 05/0 میلی لیتر
* تترا متیل اتیلن دی امین [ TEMED ] : 01/0 میلی لیتر

جهت تهیه بافر مخزن، 3 گرم تریس، 4/14 گرم گلایسین و 1 گرم SDS در یک لیتر اب مقطر حل شد. برای تهیه بافر نمونه103 نیز 10 میلی لیتر از بافر ژل متراکم کننده را با 5 میلی لیتر گلایسین، 1 گرم SDS ، 2/0 میلی لیتر محلول بروموفنول بلو و 1 میلی لیتر 2-مرکاپتواتانول در یک ظرف مخلوط کرده و سپس با اب مقطر به حجم 20 میلی لیتر می رسانیم.
برای تهیه ژل ابتدا صفحات شیشه ای و اسپیسر ها را با اب مقطر و الکل تمیز می کنیم. اسپیسر ها را در کناره های جانبی دو شیشه قرار داده و با گیره به خوبی محکم می کنیم. ابتدا به ارامی محلول ژل پایین را بین دو شیشه ریخته به طوری که حدود دو سانتیمتر از بالای شیشه را برای ریختن محلول ژل بالا خالی نگه داشته شود. بلافاصله بر روی ژل پائین اب مقطر یا ایزوبوتانل ریخته تا از مجاورت با اکسیژن هوا دور بماند و عمل پلیمریزه شدن به خوبی انجام گیرد. پس از حدود 30 دقیقه که ژل پائین کاملا پلیمریزه شد، اب مقطر را با کاغذ صافی بطور کامل خشک می کنیم. بعد از ان محلول ژل بالا را افزوده و شانه را که از قبل با اب مقطر و الکل شسته شده است را در حد فاصل دو شیشه، درون محلول ژل بالا قرار می دهیم. پس از پلیمریزه شدن ژل بالایی، صفحات شیشه ای را درون بافر تانک قرار داده و شانه در درون بافر از ژل خارج می کنیم.

مطلب مشابه :  منابع پایان نامه ارشد درموردپلاسمید، EpCAM، مولتی، انزیمی

3-6-2-2 Run کردن نمونه ها
جهت Run کردن نمونه ها، ? 15 از مخلوط رسوب باکتری و اوره 8 مولار را با ? 5 از بافر نمونه مخلوط کرده و به مدت 5 دقیقه در بن ماری 95 درجه سانتیگراد قرار می دهیم. ? 20 از مخلوط مورد نظر را در چاهک ژل ریخته و در ولتاژ اولیه 120 ولت تا خارج شدن از ژل بالایی و 160 ولت برای ژل پایینی الکتروفورز می کنیم. الکتروفورز تا زمانی ادامه پیدا می کند تا رنگ ابی کاملا به کناره پایینی ژل برسد.

3-6-2-3 رنگ امیزی با کوماسی G-2
50 کلوئیدی
رنگ امیزی با محلول کلوئیدی G-250 بر اساس روش بلاکسلی و بوئر با بعضی تغییرات انجام شد. با توجه به حالت کلوئیدی کوماسی در این روش زمینه ی ژل انچنان رنگ نمی گیرد. حساسیت این روش بارها بیش از روش رنگ امیزی با کوماسی R250 و در حدود 20 تا 30 نانوگرم پروتئین در هر باند است. در ضمن برای رنگ امیزی پلی پپتید های کوچک روش مناسبی می باشد.جهت رنگ امیزی از محلول های زیر استفاده شد :
1) محلول ثبوت ( تری کلرو استیک اسید % 20 ) : 20 گرم تری کلرو استیک اسید را در اب مقطر حل کرده، حجم نهایی را به 100 میلی لیتر می رسانیم.
2) محلول رنگ امیزی: 4/0 گرم کوماسی بلو G-250 را در 200 میلی لیتر اب مقطر حل می کنیم. سپس 200 میلی لیتر محلول اسید سولفوریک 1 مولار اضافه کرده، 3 ساعت با همزن مغناطیسی هم می زنیم. محلول را با کاغذ صافی، صاف می کنیم. سپس به ترتیب 45 میلی لیتر محلول هیدروکسید پتاسیم 10 مولار و60 میلی لیتر محلول تری کلرو استیک اسید خالص اضافه می کنیم. محلول را در دمای اتاق و به دور از نور می توان نگهداری کرد.
روش رنگ امیزی به صورت زیر است:
1) ژل را در یک ظرف شیشه ای یا پلاستیکی درب دار قرار می دهیم. مقدار کافی محلول ثبوت اضافه می کنیم و حداقل به مدت 1 ساعت روی شیکر با حرکت ارام قرار می دهیم.
2) محلول ثبوت را بطور کامل تخلیه می کنیم. مقدار کافی محلول رنگ امیزی اضافه می کنیم و ظرف را به مدت 3 ساعت در دمای 45 تا 50 درجه سانتیگراد یا به مدت 12 ساعت در دمای اتاق روی شیکر با حرکت ارام قرار می دهیم.
3) ژل را در به مدت 1 تا 2 ساعت با اب مقطر شستشو می دهیم تا زمینه شفاف گردد.

فصل چهارم : نتایج

4-1 نتایج حاصل از طراحی و انالیز بیوانفورماتیکی پروتئین EpCAM

4-1-1 مولتی توپ کایمر طراحی شده
دو اپی توپ مد نظر برای طراحی کایمر مولتی توپ EpCAM انتخاب شده و توسط یک لینکر عمومی ( EAAAK ) به هم متصل شدند و ژن کد کننده پروتئین نوترکیبی با طول 134 اسید امینه را شکل دادند. شکل 4-1 نمایش شماتیکی از محل قرار گیری اجزای تشکیل دهنده سازه را نشان می دهد.

شکل 4-1. نمای شماتیک مولتی توپ طراحی شده

4-1-2 نتایج حاصل از بهینه سازی توالی یا Optimization
در توالی نوکلئوتیدی اولیه پارامتر هایی وجود داشت که کارایی سیستم بیانی در میزبان E.coli را پایین می اورد. در نتیجه این پارامتر ها با جایگزینی نوکلئوتید های مناسب و ایجاد کدون هایی با راندمان بالا بهینه سازی شد. در تغییرات ایجاد شده نکات زیر مورد توجه قرار گرفت:
– هیچ اسید امینه ای تغییر نکند.
– با توجه به دو قسمتی بودن پروتئین مورد نظر، تا حد امکان ساختار هر بخش پروتئینی در شکل نهایی تغییر ننماید.
– قالب خواندنی104 در ژن نهایی تغییر نکند.
– کدون هایی انتخاب شود که بیشترین بیان را در میزبان داشته باشد.
– پایداری mRNA مورد بررسی و توجه قرار گیرد.
– جایگاه

Author: mitra2--javid

دیدگاهتان را بنویسید