منابع پایان نامه ارشد درمورد پروتئین، بینی، پیش، توالی

دانلود پایان نامه

های انزیم های محدود کننده در دو سر توالی بدون تغییر بماند.
پارامتر هایی که طی بهینه سازی دستخوش تغییر قرار گرفتند به شرح زیر می باشد :
1) شاخص سازگاری کدون105 یا ( CAI ) :
از لحاظ کمی مقدار تمایل کدونی، کدون های مترادف با استفاده از شاخص سازگاری کدونی یا CAI اندازه گیری می شود که بین صفر تا یک متغیر است. زمانی که این شاخص برابر صفر باشد به این معناست که همه کدون های مترادف به یک میزان در یک ژن استفاده شده اند و مقدار برابر یک به معنای حداکثر بودن میزان تمایل کدونی بوده و در این مورد فقط کدون های بهینه مورد استفاده قرار گرفته اند که بالطبع آن نشان دهنده بیان بیشتر و دائم یک ژن و به عبارتی تعیین کننده سطح بیان آن خواهد بود. با توجه به این پارامتر میزان CAI برابر با یک، بهترین حالت بیانی ممکن و بیشتر از 8/0 ، حالت بیانی خوب و 6/0 ، حالت بیانی متوسط را دارا خواهند بود. در توالی اولیه طراحی شده میزان CAI برابر با 69/0 بود که با تغییرات نوکلئوتیدی اعمال شده این میزان به 86/0 تغییر یافت. (شکل 4-2 )

شکل 4-2. شاخص سازگاری کدون. سمت راست: قبل از بهینه سازی، سمت چپ: بعد از بهینه سازی

بدین ترتیب میزان فراوانی کدون های بهینه106 (FOP ) نیز افزایش یافت به صورتی که کدون های کاملا اپتیموم برای توالی امینواسیدی در نظر گرفته شده از %46 در توالی اولیه به %62 در توالی بهینه شده افزایش یافتند. دیگر کدون ها هم در بهترین حالتی که در توالی می توانستند حضور یابند به صورت بهینه در امدند. FOP اپتیموم نشان گر بیان کاملا دقیق کدون های کد کننده امینو اسید ها هستند، بدین معنی که با توجه به میزان تغییراتی که در کل توالی می تواند صورت گیرد، برای یک امینو اسید خاص، این کدون در میزبان بالاترین راندمان بیانی را می تواند داشته باشد. (شکل 4-3)

شکل 4-3. میزان فراوانی کدون های بهینه. سمت چپ: قبل از بهینه سازی، سمت راست: بعد از بهینه سازی

2) شاخص محتوای G-C
میانگین محتوای G-C یک توالی مناسب بین %30 تا %70 ( بطور میانگین % 50 ) می باشد. شاخص محتوای G-C توالی اولیه از میزان % 8/42 به % 28/50 در توالی بهینه سازی شده افزایش یافت که این امر سبب افزایش نیمه عمر mRNA مولتی توپ طراحی شده می شود. (شکل 4-4 )

شکل 4-4. شاخص محتوای G-C. سمت راست: قبل از بهینه سازی، سمت چپ: بعد از بهینه سازی.

با توجه به پارامتر های تغییر یافته، توالی 422 نوکلئوتیدی نهایی برای ژن مولتی توپ EpCAM در شکل 4-5 نشان داده شده است. همچنین در شکل 4-6 نیز توالی اولیه و توالی بهینه سازی شده را بطور مقایسه ای و نوکلئوتید به نوکلئوتید می توان مشاهده کرد.

شکل 4-5. ترادف مولتی توپ ژنی مورد نظر پس از بهینه سازی کدون های مربوطه جهت بیان در میزبان E.coli .

شکل 4-6. مقایسه نوکلئوتید بصورت نظیر به نظیر در توالی های اولیه و بهینه سازی شده.

4-1-3 انالیز ساختار mRNA
mRNA های متفاوت درون یک سلول، دوره زندگی (پایداری) متفاوتی دارند. در سلول‌های باکتریایی، هر یک از mRNAها از چند ثانیه تا بیش از یک ساعت می‌توانند زندگی نمایند، در سلول‌های پستانداران، دوره زندگی mRNAها از چند دقیقه تا چند روز متغیر است. پایداری بیشتر mRNA سبب تولید پروتئین‌های بیشتر از آن mRNA می‌شود. به طور کلی دوره زندگی mRNA در پروکاریوت ها کوتاه‌تر از یوکاریوت‌ها است.
ساختار ثانویه ی mRNA قبل و بعد از بهینه سازی کدون ها به کمک نرم افزار mfold مورد ارزیابی قرار گرفت و از لحاظ میزان حداقل انرژی ( نشانه پایداری ساختار ) وعدم داشتن ساختار های نامناسب مورد ارزیابی قرار گرفت. انالیز ها نشان داد که در نقطه ی شروع ترجمه ساختار های نامناسب نداریم. علاوه بر ان میزان حداقل انرژی این ساختار قابل قبول بوده و برای سنتز یک mRNA به منظور ترجمه در سیستم پروکاریوتی مناسب است. هم چنین مشخص شد که بعد از بهینه سازی کدون ها، mRNA تولیدی دارای انرژی پایین تری ( 97/113- = ?G ) نسبت به حالت اولیه است ( 70/91 – = ?G ) و این نشان دهنده پایدار تر بودن ساختار mRNA بعد از بهینه سازی است. در شکل 4-7 ، ساختار دوم mRNA پیش بینی شده بعد از بهینه سازی ملاحظه می شود.

شکل 4-7. ساختار دوم mRNA پیش بینی شده بعد از بهینه سازی

4-1-4 ساختار دوم پروتئین
ساختار دوم پروتئین حاصل از توالی بهینه شده نشان دهنده وجود ساختار های متفاوت در دو اپی توپ متصل به هم و قابل تمایز از یکدیگر است که به خوبی می توان ان ها را از هم تمییز داد. این ساختار 134 اسید امینه ای از %54/42 هلیکس الفا ، %54/42 ساختار رندوم کویل و %93/14 صفحات بتا تشکیل شده است. در شکل 4-8 ، ساختار دوم پروتئین نوترکیب پیش بینی شده نمایش داده شده است.

شکل 4-8 . پیش بینی ساختار دوم پروتئین

مطلب مشابه :  پایان نامه رایگان دربارهدینامیکی، مقدار خطا

4-1-5 پیش بینی ایمیوژنیک اپی توپ های شناسایی شونده توسط سلول های لنفوسیت B
اپی توپ های خطی سلول های B-Cell ( لنفوسیت B ) ساختار طراحی شده به کمک سرورهای آنلاین Bepipred 1.0 و Discotope 1.2 و اپی توپ غیر پیوسته B-Cell توسط سرور آنلاین (SEPPA ) پیش بینی شد و در نهایت نیز به کمک سرور Ellipro هر دو نوع اپی توپ به طور همزمان پیش بینی شد . این پیش بینی ها بر اساس دسترسی حلال و قابلیت انعطاف پذیری ساختار طراحی شده انجام شد. با توجه به نتایج حاصله مشخص شد که ساختار پروتئینی حاصل هم از لحاظ خطی و هم از لحاظ فضایی برای سلول های لنفوسیت B قابل شناسایی می باشد. به طوری که بیشترین امتیاز ممکن برای یک اپی توپ مناسب برابر با یک و امتیاز های کمتر از 5/0 نشان دهنده غیر اپی توپ بو
دن توالی ها دارد. در شکل 4-9 اپی توپ های خطی ساختار مولتی توپ پروتئینی برای لنفوسیت B و در شکل 4-10 اپی توپ های غیر خطی ساختار مولتی توپ پروتئینی برای لنفوسیت Bنشان داده شده است.

شکل 4-9. اپی توپ های خطی ساختار مولتی توپ پروتئینی برای لنفوسیت B

شکل 4-10. اپی توپ های غیر خطی ساختار مولتی توپ پروتئینی برای لنفوسیت B

4-1-6 پیش بینی اپی توپ های شناسایی شونده توسط سلول های لنفوسیت T در ساختار پروتئین نوترکیب
بدین منظور از پایگاه های اطلاعاتی ونرم افزاری CTLpred و NetCTL استفاده شد. این پایگاه ها ی مختلف در مجموع، توانایی پیش بینی اپی توپ های شناسایی شونده توسط لنفوسیت T سازگار با 12 سوپرتایپ مختلف MHC کلاس I رادارا هستند. هر یک از این پایگاه ها دارای سیستم امتیاز دهی خاصی بوده و تقریبا با هم متفاوت اند. پایگاه NetCTL نتایج انالیز را بر اساس اختصاصیت و حساسیت امتیاز دهی می کند. پایگاه CTLpred نیز با حداکثر امتیاز 1 و حد استانه 51/0 اپی توپ های شناسایی شونده توسط سلول های لنفوسیت T را پیش بینی می کند. در شکل 4-11 ، اپی توپ های شناسایی شونده توسط سلول های لنفوسیت T در ساختار مولتی توپ نوترکیب با استفاده از پایگاه CTLpred نشان داده شده است.

شکل 4-11 . اپی توپ های شناسایی شونده توسط سلول های لنفوسیت T در ساختار مولتی توپ نوترکیب با استفاده از پایگاه CTLpred

4-1-7 پیش بینی تمایل اتصال پپتید ها به مولکول MHC
به منظور پیش بینی تمایل اتصال پپتید ها به MHC ، از پایگاه اطلاعاتی و نرم افزاری NetMHC استفاده شد. این پایگاه پس از انالیز توالی پروتئین، میزان تمایل اتصال پپتید ها به MHC را بصورت مقادیری با مقیاس نانومولار پیش بینی می کند. بطوری که بیشترین قدرت اتصال معادل مقدار عددی کمتر از nM 50 بوده و اتصالات سست نیز مقادیر عددی کمتر از nM 500 را دارا هستند. بر اساس انالیز حاصل از پیش بینی این پایگاه، یکی از پپتید ها دارای قدرت اتصالی بسیار قوی و دو اپی توپ دیگر دارای قدرت اتصال سست با مولکول MHC هستند. نتایج انالیز در شکل 4-12 نشان داده شده است.

شکل 4-12 پیش بینی تمایل اتصال پپتید ها به مولکول MHC

4-1-8 شناسایی نواحی تداخل کننده
از نرم افزار Raptor x جهت شناسایی نواحی تداخل کننده و بر هم زننده ساختار در پروتئین نوترکیب استفاده شد . با توجه به توالی اسید امینه ای، این نرم افزار نواحی تداخل کننده در فولدینگ مناسب را تنها % 2 از کل اسید امینه ها پیش بینی کرد. نتیجه ی حاصل از این ارزیابی در شکل 4-13 نشان داده شده است.

شکل 4-13. پیش بینی نواحی تداخل کننده در ساختار پروتئین

4-1-9 پیش بینی ساختار سوم پروتئین
ساختمان سوم پروتئین ، معرف ساختمان سه بعدی رشته پلی پپتید در فضا است. ممکن است در ساختمان سوم ، ساختمانهای دوم نیز وجود داشته باشند. و یا ساختمان اول، مستقیماً به ساختمان سوم تبدیل شود. تشکیل ساختمان سوم نیز پدیده خود بخودی است و از ساختمان اول پیروی می کند . تشکیل انواع پیوند های قوی و ضعیف بین اسید آمینه ها، سبب پایداری ساختمان سوم می شود . ساختارهای نوع سوم با انواع متفاوتی از پیوندهای شیمیایی بهم متصل می‌شوند که یکی از آنها پیوند دی سولفیدی است. این نوع پیوند غالبا وقتی که سیستئین یا سیستئین جزئی از سلسله اسید آمینه‌ای است، دیده می‌شود.
از نرم افزار (I-Tasser ) جهت پیش بینی ساختار سوم پروتئین استفاده شد . این نرم افزار بر اساس اثر توالی بر ساختار بر عملکرد، برای پیش بینی ساختار سوم استفاده می کند. نتایج انالیز های کامپیوتری و پیش بینی ساختار ها نشان داد که دو اپی توپ کایمر طراحی شده به خوبی از لحاظ فضایی از هم جدا بوده و قابلیت شناسایی توسط انتی بادی های اختصاصی خود را دارند. در شکل 4-14 ساختار سوم پروتئین پیش بینی شده نشان داده شده است.

شکل 4-14. ساختار سوم پروتئین

4-1-10 نتایج حاصل از تعیین میزان آنتی ژنیک بودن و محلول بودن پروتئین
جهت پی بردن به میزان آنتی ژنیک بودن پروتئین مولتی توپ طراحی شده از نرم افزار آنلاین و (Antigen pro ) استفاده شد . با توجه به این که میزان انتی ژنیک بودن این پروتئین نوترکیب توسط نرم افزار، % 93 اندازه گیری شد، می توان گفت که پروتئین نوترکیب طراحی شده می تواند کاملا در نقش یک انتی ژن برای سلول های انسانی ظاهر شود.
میزان حلالیت پروتئین نوترکیب با استفاده از خصوصیات بارز هیدروفوبیکی و قطبیت زنجیره های جانبی اسید امینه های موجود در ساختار پروتئین تعیین می شود. برای تعیین میزان حلالیت پروتئین نوترکیب نیز از نرم افزار های ( Sol pro ) و ( Raptor x ) استفاده شد. طبق نتایج بدست امده از این نرم افزار ها، مقدار حلالیت پروتئین نوترکیب % 80 پیش بینی شد. پیش بینی میزان در دسترس بودن اسید های امینه پروتئین نوترکیب برای حلال107 ( ACC ) نیز نشان داد که فقط تعداد محدودی از اسید های امینه در داخل پروتئین قرار داشته و بیشتر اسید های امینه یا در سطح قرار گرفته اند و یا بطور نسبی با حلال در ارتباط اند. شکل 4-15 در دسترس بودن اسید های امینه پروتئین نوترکیب برای حلال را نشان می دهد.

مطلب مشابه :  منابع پایان نامه دربارهچای، عصبی، دمای، سیلسیوس

شکل 4-15. میزان در دسترس بودن اسید های امینه پروتئین نوترکیب برای حلال

4-1-11 بررسی پایداری پروتئین نوترکیب
پایداری ساختار سه بعدی پروتئین نوترکیب به کمک نرم افزار Swiss-pdb viewer و سرور RAmPAGE با به حداقل رساندن انرژی ساختار ارزشیابی شد و نمودار راماچاندران ان ترسیم گشت. هر اسید امینه ای تنها قادر است زوایای خاصی را با توجه به
اسید امینه های محیط به خود بگیرد و تنها قادر است در محدوده ی همین زوایا دارای حرکات پیچشی و خمشی باشد. با توجه به این نکته، اسید های امینه ی تشکیل دهنده پروتئین نوترکیب مورد بررسی قرار گرفتند و مشخص شد که % 72 از اسید های امینه در ناحیه کاملا صحیح ، % 9/15 اسید امینه ها در ناحیه ی قابل قبول و تنها % 1/12 اسید های امینه در ناحیه خارج از زوایای مجاز قرار گرفته اند. در شکل 4-16 ، نمودار راماچاندران اسید امینه های پروتئین نوترکیب نشان داده شده است.

شکل 4-16 . نمودار راماچاندران اسید امینه های پروتئین نوترکیب

4-2 سنتز شیمیایی DNA کایمر طراحی شده نو ترکیب
توالی طراحی شده کایمر مورد نظر توسط شرکت Biomatik کانادا بصورت شیمیایی سنتز شد و درون وکتور pBSK قرار داده شد . این وکتور قبلا به نام pBMH شناخته می شد که طولی برابر با bp 2907 دارد. این وکتور دارای ژن مقاومت به انتی بیوتیک امپی سیلین می باشد که می توان از ان برای جداسازی کلونی های نوترکیب استفاده کرد. طول توالی بعد از سنتز ژن به داخل پلاسمید به bp 3334 رسید. توالی سنتز شده تمام مراحل کنتری کیفیت را با موفقیت گذارند. از جمله این مراحل می توان به موارد زیر اشاره کرد.
– تائید صحت توالی ژن نوترکیب
– تائید صحت توالی پلاسمید حامل
– تائید صحت شکل خواندن ( Reading Frame ) در فرایند رونویسی
– تائید اندازه ژن سنتز شده به کمک هضم انزیمی ( شکل 4-17 )

شکل 4-17. تائید اندازه ژن سنتز شده به کمک هضم انزیمی

– تائید صحت قابلیت تکثیر ژن به کمک تکنیک PCR و عدم وجود هرگونه الودگی در ان
– کیفیت مناسب DNA سنتز شده به کمک تکنیک اسپکتروسکوپی108 و عدم وجود هرگونه الودگی در ان
– شکل ظاهری شفاف و عدم وجود هرگونه ذره ی خارجی در ان
سفارش مذکور به شکل پودر لیوفیلیزه و در حجم 10 میکروگرم دریافت شد و سپس بصورت استوک قابل استفاده با توجه به دستور العمل شرکت سازنده درامد. نقشه ی ژنی پلاسمید حاوی DNA نوترکیب مولتی توپ EpCAM در شکل 4-18 نمایش داده شده است. در این شکل جایگاه ژن مورد نظر، نحوه قرار گیری ان در پلاسمید حامل، جایگاه های انزیم های محدود کننده و همچنین جایگاه ژن مقاومت به انتی بیوتیک امپی سیلین نشان داده شده است.

شکل 4-18. نقشه ی ژنی پلاسمید حاوی DNA نوترکیب مولتی توپ EpCAM

4-3 کلونینگ پلاسمید- AMP+ pBSK حاوی DNA مولتی توپ EpCAM
جهت تکثیر پلاسمید حاوی ژن سنتز شده ارسال شده توسط شرکت تولیدی، فرایند ترانسفورمیشن برای باکتری های کامپتنت E.coli سویه Top 10 انجام شد و از کلونی های رشد کرده در محیط دارای انتی بیوتیک امپی سیلین، تک کلونی انتخاب شد و سپس از تک کلونی های انتخاب شده به روش لیز قلیایی استخراج پلاسمید صورت گرفت. جهت تائید حضور پلاسمید در محلول بدست امده، الکتروفورز انجام شد. با پدیدار گشتن باند bp 3334 در ژل، حضور پلاسمید حاوی ژن مولتی توپ EpCAM محرز گشت. در شکل 4-19 نتیجه حاصل از الکتروفورز محصول استخراج پلاسمید نشان داده شده است.

شکل 4-19. تائید حضور پلاسمید حاوی ژن مولتی توپ EpCAM در محصول استخراج پلاسمید

پس از این که وجود

Author: mitra2--javid

دیدگاهتان را بنویسید