منابع پایان نامه ارشد درمورد پروتئین، آنتی، پیش، EpCAM

ن می توانست به عنوان یک انتقال دهنده داروهای شیمی درمانی، سم ها و رادیوایزوتوپ های درمانی به کار گرفته شود. اما این اپتامر ها قادر بودند پروتئین های EpCAM در مقیاس پائین را نیز شناسایی کرده و بافت های طبیعی بدن را نیز مورد هدف قرار دهند. (پائولی48 و همکاران، 2003 ; لی49 و همکاران، 2014)
Huks-IL2 یک ایمنو سایتوکان کونژوگه حاوی آنتی بادی اختصاصی پروتئین EpCAM است که از انتهای خود با دو مولکول اینترلوکین 2 ( IL-2 ) متصل شده است . اتصال این ساختار به سلول های توموری با بیان بالای EpCAM موجب می شود تا از طریق مولکول IL-2 خود، تولید سلول های T کشنده را افزایش داده و همچنین از طریق سلول های کشنده طبیعی50(NK Cells ) سیستم ایمنی ذاتی را در محیط اطراف تومور فعال کند. ( کانر51 و همکاران، 2013)
برخی اوقات درصد گلیکوزیله شدن پروتئین EpCAM در سرطان های مختلف و همچنین در مراحل مختلفت پیشرفت سرطان متفاوت است . به همین دلیل آنتی بادی هایی که ساختار فضایی کربوهیدرات های متصل به EpCAM ، در تشخیص پروتئین توسط آن ها موثر است توانایی چندانی جهت اتصال به پروتئین EpCAM ندارند، آنتی بادی مونوکلونال Ho-3 که از آنتی بادی Catumaxomab مشتق شده است برای اتصال به پروتئین EpCAM به کربوهیدرات های متصل به پروتئین نیاز ندارد و می تواند بدون حساسیت به سطح گلیکوزیله شدن پروتئین به آن متصل شود . بنابراین توانایی گسترده ای برای اتصال به تومورهای EpCAM+ متنوع دارد. (راف52 و همکاران، 2007)
آنتی بادی های دو اختصاصیتی53 (bs Ab ) مولکول هایی هستند که نسبت به دو آنتی ژن اختصاصیت دارند و کلاس جدیدی از عوامل درمانی ایمنی زایی را شکل می دهند. (فیشر54 و لجر55، 2007 ; مولر56 و کونترمان57، 2007) یکی از کاربردهای چنین آنتی بادی هایی اتصال به آنتی ژن های توموری از یک سمت و اتصال به سلول های ایمنی از طریق بازوی دیگر خود هستند که موجب فعال شدن سلول های ایمنی از طریق غیر مستقیم برای از بین بردن سلول های توموری می شود. (زیدلر58 و همکاران، 1999و2000 ; راف و لیندهافر59، 2001 ; رویش60 و همکاران، 2006)
EpCAMxCD3 یکی از bsAB هایی است که موجب لیز سلولی در سلول های سرطان تخمدان می شود. (استراوس61 و همکاران، 1999 ; مارمه62 و همکاران، 2002) EpCAMxCD3 با نزدیک کردن سلول های سرطانی و سلول های T کشنده بطور غیر مستقیم موجب از بین بردن سلول سرطانی می شود . آن ها از طریق یک بازوی خود به مولکول CD3 لنفوسیت متصل شده و از طریق بازوی دیگر به پروتئین EpCAM سلول های توموری متصل می شوند. با فعال شدن لنفوسیت ، سایتوکاین های مختلفی مانند TNF-? ، IFN-? ، گرآنزیمB و پرفورین تولید می شوند. (سالنیکوف63 و همکاران، 2009 ; موتوشی64 و همکاران، 2012)
ING1 یا heMAb یک IgG مهندسی ژنتیک شده است که به پروتئین EpCAM با تمایل اتصال بالایی متصل می شود و سلول های آدنوکارسینوما را در شرایط آزمایشگاهی از بین می برد ولی در شرایط فیزیولوژیک، تنها از رشد تومور جلوگیری می کند . مکانیزم عمل آن از طریق فرایند (ADCC) یا از بین بردن سلول با واسطه آنتی بادی 65 است . طبق مطالعات انجام شده استفاده از ING1 در مراحل اولیه ی متاستاز سلول های سرطانی می تواند مفید باشد. (روان66 و همکاران، 2003)
از منظری دیگر ، یکی از راه های مورد استفاده در طی درمان سرطان، پائین آوردن بیان ژن پروتئین EpCAM به کمک RNA های آنتی سنس است که در نهایت منجر به کاهش سرعت تکثیر و متابولیسم سلول های سرطانی می شود . (ابینگر67 و همکاران، 2013) دانشمندان در یکی از این موارد با استفاده از مولکول های SiRNA توانستند بیان ژن EpCAM را در سلول های سرطانی سینه به شدت کاهش داده و در نتیجه تکثیر و مهاجرت سلول های سرطانی سینه را به بافت های مجاور محدود کنند. (استا68 و همکاران، 2004 ; وینکلر69 و همکاران، 2009)
از دیگر روش های خاموش کردن ژن epcam استفاده از پروتئین انگشت روی70 است که می تواند به پروموتر ژن متصل شود و از بیان آن جلوگیری کند. (گومانس71 و همکاران، 2007) در تحقیقی دیگر دانشمندان توانستند با متیله کردن هدف دار پروموتر ژن epcam از بیان آن جلوگیری کنند . بدین صورت که با استفاده از یک پروتئین انگشت روی مهندسی ژنتیک شده که می توانست به پروموتر ژن epcam متصل شود و دارای یک دومین کاتالیکی متیل ترانسفرازی بود، پروموتر ژن را متیله کرده و بیان آن را خاموش کنند. ( نونا72 و همکاران، 2014)

فصل 3 : مواد و روش ها

3-1 مواد مورد استفاده
در انجام این پایان نامه از عوامل زیر استفاده شد :

3-1-1 باکتری مورد استفاده
در این مطالعه در مرحله کلونینگ ژن مولتی توپ EpCAM از باکتری E.coli سویه TOP10 و در مرحله ی ساب کلونینگ از باکتری E.coli سویه BL21(DE3)استفاده شد . این باکتری ها ابتدا بصورت لیوفیلزه می باشند و برای استفاده از آن، پودر باکتری را به 5 میلی لیتر محیط کشت مایع LB اضافه کرده و در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت یک شبانه روز کشت داده شد .

3-1-2 پلاسمید
در مرحله ی ساب کلونینگ از پلاسمید بیانی (pet-28a ) که دارای پارامترهای بیان کننده و همچنین جایگاه های برش آنزیمی دلخواه است استفاده شد . این پلاسمید دارای جایگاه های مختلف برای انواع انزیم های محدود کننده می باشد که می توان ژن مورد نظر را به کمک انها وارد پلاسمید کرد. همچنین دارای ژن مقاومت به انتی بیوتیک کانامایسین بوده که به باکتری ترانسفورم شده امکان بقاء را در محیط حاوی کانامایسین می دهد. جهت بیان قطعه ژن کلون شده در ان هم دارای پارامتر های بیانی مانند پروموتر lac می باشد که در حضور القاگرIPTG شروع به بیان ژن مورد نظر می کند
. در شکل 3-1، نقشه ژنی پلاسمید pet-28a نشان داده شده است.

3-1-3 آنزیم ها
از آنزیم های محدودالاثر (NcoI ) و (XhoI ) که از شرکت فرمنتاز73 لیتوانی تهیه شدند و از آنزیم اتصال دهنده T4 DNA Ligase هم در مرحله ی Ligation استفاده گردید . این آنزیم ها در شرایط دمایی 20- درجه سانتیگراد نگهداری شدند .

3-1-4 کیت های ازمایشگاهی
کیت استخراج DNA از ژل و کیت استخراج پلاسمید از شرکت فرمنتاز لیتوانی تهیه شدند و در شرایط دمایی 4 درجه سانتیگراد نگهداری شدند.

3-1-5 انتی بیوتیک ها
آنتی بیوتیک های آمپی سیلین و کانامایسین نیز با غلظت مناسب تهیه شدند و در تیوب های 5/1 میلی لیتری تقسیم گردید و در شرایط دمایی20- درجه سانتیگراد نگهداری شدند.

3-1-6 محیط کشت باکتری
در این مطالعه از محیط کشت های LB آگار و محیط کشت آگار جهت تکثیر باکتری استفاده شد.

3-1-7 ژل الکتروفورز
پودر آگارز Low شرکت هیسپانلب74 تهیه شد و جهت ساختن ژل الکتروفورز مورد استفاده قرار گرفت.

3-1-8 مواد شیمیایی
کلیه مواد شیمیایی از شرکت مرک آلمان با درجه ی خلوص بیولوژی مولکولی تهیه گردید و در مراحل مختلف مطالعه از جمله تولید ژل الکتروفورز (SDS-page ) مورد استفاده قرار گرفت.

3-1-9 وسایل و تجهیزات آزمایشگاهی
در انجام این پایان نامه از وسایل و تجهیزات زیر استفاده شد :
1- سمپلر در سایزهای مختلف
2- نوک سمپلر آبی، زرد، کریستالی
3- میکروتیوب های 2/0 ، 5/0 و 5/1
4- پلیت یکبار مصرف 10 سانتیمتری
5- لوله ی آزمایش 160 × 16 سیماکس
6- اتوکلاو جهت ضد عفونی کردن وسایل پلاستیکی و محیط کشت ها
7- دستگاه فور جهت ضد عفونی کردن وسایل شیشه ای
8- انکوباتور ساخت شرکت ممرت75 ایالات متحده امریکا (شکل 3-1 )

شکل 3-1. انکوباتور ممرت

9- شیکرانکوباتور ساخت شرکت ان بی اس76 ایالات متحده امریکا (شکل 3-2 )

شکل 3-2. شیکر انکوباتور ان بی اس

10- تانک الکتروفوز افقی
11- تانک الکتروفورز (SDS-Page )
12- دستگاه مولد ولتاژ (شکل 3-3 )

شکل 3-3. تانک الکتروفورز و دستگاه مولد ولتاژ

13- گرماساز77
14- سانتریفیوژ ساخت شرکت اپندورف78 المان (شکل 3-4 )

شکل 3-4. سانتریفیوژ اپندورف المان

15- بن ماری ساخت شرکت ممرت ایالات متحده امریکا (شکل 3-5 )

شکل 3-5. بن ماری ممرت

16- دستگاه ترموسایکلر ساخت شرکت پرکین المر79 ایالات متحده امریکا ( شکل 3-6 )

شکل 3-6. ترموسایکلر پرکین المر

– دستگاه تصویر ساز ژل80 ساخت شرکت سینژن انگلستان ( شکل3-7)

شکل 3-7. دستگاه تصویرساز ژل سینژن

3-2 طراحی و آنالیز بیوانفورماتیکی مولتی توپ پروتئین EpCAM

3-2-1 طراحی مولتی توپ کایمر
توالی مورد نظر برای طراحی مولتی توپ از طریق سایت های Swiss-port / Uniprot KB و مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی81 (NCBI) بدست آورده شد و دو اپی توپ مورد نظر از طریق لینکر عمومی (EAAAK)5 به هم متصل شدند . توالی های انتخاب شده حد فاصل اسید آمینه های 24 تا 74 (اپی توپ شناسایی شونده توسط آنتی بادی MOC 31 ) و اسید آمینه های 117 تا 167 ( اپی توپ های شناسایی شونده توسط آنتی بادی 311-1K2 ) قرار داشتند . سپس در انتهای 3′ توالی ، 6 اسید آمینه ی هیستیدین (His-Tag ) قرار داده شد و کدون پایان (TAA ) هم بعد از آن قرار گرفت . در انتها نیز جایگاه های برش آنزیمی برای آنزیم های محدود کننده NcoI و BamHI در سر ‘5 توالی و جایگاه برش آنزیمی برای آنزیم محدود کننده XhoI در سر ‘3 توالی قرار داده شد .

3-2-2 بهینه سازی توالی یا Optimization
چون مولتی توپ طراحی شده فاقد هر گونه گلیکولیزاسیون بود، میزان پروکاریوتی E.Coli برای فرایند کلونینگ انتخاب شد . به منظور دسترسی به بیشترین میزان بیان صحیح در میزبان پروکاریوتی توالی 422 نوکلئوتیدی کایمر طراحی شده توسط شرکت Genscript ایالات متحده آمریکا بهینه سازی شد. پارامترهایی که توسط این شرکت برای فرایند بهینه سازی در نظر گرفته شد، شامل موارد زیر می شود :
1. codon usage میزبان
2. محتوای CG
3. ساختار دوم mRNA پیش بینی شده .
4. از بین بردن نواحی برش ناخواسته .
5. جایگاه های آنزیمی آنزیم های محدودالاثر که ممکن است در فرایند کلونینگ اختلال ایجاد کنند.
6. به حداقل رساندن نواحی تکرار شونده مستقیم یا غیر مستقیم

3-2-3 پیش بینی ایمیوژنیک اپی توپ های سلول های B
اپی توپ های خطی سلول های B-Cell ( لنفوسیت B ) ساختار طراحی شده به کمک سرورهای آنلاین Bepipred 1.0 و Discotope 1.2 (لارسن82 و همکاران، 2006 ; ساها83 و راگاوا84، 2006) و اپی توپ غیر پیوسته B-Cell توسط سرور آنلاین (SEPPA ) پیش بینی شد و در نهایت نیز به کمک سرور Ellipro هر دو نوع اپی توپ به طور همزمان پیش بینی شد . این پیش بینی ها بر اساس دسترسی حلال و قابلیت انعطاف پذیری ساختار طراحی شده انجام شد. (اندرسن85 و همکاران، 2006 ; پونومارنکو86 و همکاران، 2008 ; سان87 و همکاران 2009)

3-2-4 پیش بینی ایمیوژنیک اپی توپ های سلول های T
جهت پیش بینی، انالیز و بررسی اپی توپ های موجود در مولتی توپ طراحی شده از نرم افزار های انلاین NetCTL و CTLpred استفاده شد.
.
3-2-5 پیش بینی میزان تمایل اتصال اپی توپ ها به MHC
جهت پیش بینی میزان تمایل اتصال اپی توپ ها به مولکول MHC از پایگاه اطلاعاتی NetMHC استفاده شد.

3-2-6 پیش بینی ساختار دوم mRNA
ساختار دوم mRNA مولتی توپ طراحی شده بوسیله ی نرم افزار (mfold ) ارزشیابی شد و حالت نرمال ساختار و بهینه سازی شده از لحاظ فولدینگ و انرژی ترمودینامیکی مقایسه شد. (زوکر88، 2003 ; ساتو89 و همکاران، 2009)

3-2-7 پیش بینی س
اختار دوم پروتئین
ساختار دوم پروتئین نو ترکیب توسط سرور پیشرفته پیش بینی ساختار دوم90 (APSS2) و نرم افزار(GOR-IV ) پیش بینی شد.

3-2-8 شناسایی نواحی تداخل کننده
از نرم افزار Raptor X جهت شناسایی نواحی تداخل کننده و بر هم زننده ساختار در پروتئین نوترکیب استفاده شد .

3-2-9 تعیین ساختار سوم پروتئین
از نرم افزار (I-Tasser )91 جهت پیش بینی ساختار سوم پروتئین استفاده شد . این نرم افزار بر اساس اثر توالی بر ساختار بر عملکرد، برای پیش بینی ساختار سوم استفاده می کند.

3-2-10 تعیین میزان آنتی ژنیک بودن و محلول بودن پروتئین
جهت پی بردن به میزان آنتی ژنیک بودن پروتئین مولتی توپ طراحی شده از نرم افزار آنلاین (Antigen pro ) استفاده شد و برای تعیین میزان حلالیت پروتئین نوترکیب نیز از نرم افزار های ( Sol pro ) و (Raptor x ) استفاده شد.

3-2-11 تعیین میزان پایداری پروتئین
پایداری ساختار سه بعدی پروتئین نوترکیب به کمک نرم افزار Swiss-pdb viewer و سرور RAmPAGE با به حداقل رساندن انرژی ساختار ارزشیابی شد و نمودار راماچاندران ان ترسیم گشت.

3-3 سنتز شیمیایی DNA کایمر طراحی شده نو ترکیب

3-3-1 سنتز شیمیایی ژن نوترکیب
توالی طراحی شده کایمر مورد نظر توسط شرکت Biomatik کانادا بصورت شیمیایی سنتز شد و درون وکتور pBSK قرار داده شد .

3-3-2 پایداری و شرایط نگهداری DNA سنتز شده
DNA لیوفیلیزه شده می تواند توسط بافر TE استریل یا آب بدون نوکلئاز در PH طبیعی با توجه به امکانات محیط آزمایشگاه بصورت محلول دربیاید . بعد از محلول سازی می توان آن را در دمای بین20- تا 80- درجه سانتیگراد برای مدت طولانی نگهداری کرد . DNA لیوفیلیزه شده، محلول شده به کمک بافر TE می تواند به مدت 6 ماه در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شود در حالی که اگر از آب برای محلول سازی استفاده شود امکان نگهداری در 4 درجه سانتیگراد وجود ندارد.

3-3-3 محلول سازی DNA لیوفیلیزه
قبل از باز کردن تیوب حاوی DNA ، ابتدا به مدت کوتاهی تیوب سانتریفیوژ شد تا DNA های متصل به دیواره جدا شوند . در صورت عدم سانتریفیوژ ممکن است مقداری از ذخیره ی DNA از دسترس خارج شود.
1. استوک اصلی: µg 10 از DNA لیوفیلیزه در µg 100 از بافر TE حل شد .
2. استوک مورد استفاده: در یک میکروتیوب دیگر µg 1 از استوک اصلی در µg10 از بافر TE حل شد. ( غلظت نهایی به ng/ µl10 رسید.)

3-4 کلونینگ پلاسمید- AMP+ pBSK حاوی DNA مولتی توپ EpCAM
جهت تکثیر پلاسمید حاوی ژن مولتی توپ EpCAM مراحل زیر طی شد:

3-4-1 آماده سازی باکتری شایسته
جهت اماده سازی باکتری Top 10 برای پذیرش پلاسمید ابتدا باید ان را کامپتنت یا شایسته سازی، برای پذیرش پلاسمید کرد.

3-4-1-1 مواد و محلول ها
– محلول کلرید کلسیم 0.1 مولار
– LB براث بدون آنتی بیوتیک
– LB براث حاوی آمپی سیلین ( پس از ساختن براث و سپس سرد شدن ان بعد از اتوکلاو کردن،

پیام بگذارید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *